r - 用于分析微阵列基因表达数据的 limma 问题 - 可能与设计矩阵有关

Question

我对 R 相当陌生，最近开始使用它来分析一些微阵列数据。分析的总体目标是采用 DC2 并比较该人群中的 WT 与 KO 组。但是我在 limma 处理方面遇到了一些问题。使用 oligo 包处理数据后，我尝试使用 limma 创建用于分析的设计矩阵。这是我对 DC2 的 ExpressionSet 的工作流程:

pData(DC2)

         index filename genotype cell_type
1 KO DC2     2 HP10.CEL       KO       DC2
2 KO DC2     3 HP11.CEL       KO       DC2
3 KO DC2     4 HP12.CEL       KO       DC2
1 WT DC2    10  HP7.CEL       WT       DC2
2 WT DC2    11  HP8.CEL       WT       DC2
3 WT DC2    12  HP9.CEL       WT       DC2    

design <- model.matrix(~DC2$genotype)
design

  (Intercept) DC2$genotypeWT
1           1              0
2           1              0
3           1              0
4           1              1
5           1              1
6           1              1


fit <- lmFit(DC2, design)
fit <- eBayes(fit)
toptable(fit)

这将输出基因列表，如下所示:

            logFC        t      P.Value    adj.P.Val        B
17551163 14.09722 208.2627 2.990326e-13 2.700912e-10 17.14467
17511316 13.91167 205.0811 3.292503e-13 2.700912e-10 17.12716
17551167 13.92093 204.5801 3.343243e-13 2.700912e-10 17.12434
17375373 13.76320 202.1271 3.605170e-13 2.700912e-10 17.11025
17550685 13.74022 201.5428 3.671032e-13 2.700912e-10 17.10682

但是，当我使用以下代码手动检查(仅采用第一个功能)时:

toptable(fit, n=1)
genename <- rownames(toptable(fit, n=1))
typeMean <- tapply(exprs(DC2)[genename,], DC2$genotype, mean)
typeMean["KO"] - typeMean["WT"]

相同特征“17551163”的输出不同

     KO 
0.04538317 

我试图四处寻找答案，但没有运气。我假设这可能与矩阵设计有关？任何帮助将不胜感激。

谢谢

Answer 1

对于那些跳过问题下方评论中的讨论的人来说，这是一个答案。

使用 lmFit 进行估算后和 eBayes我们可以质疑我们在 model.matrix 中提供的所有对比之间的最高区分基因。步。

在这里，作者设计如下:design <- model.matrix(~DC2$genotype) .请记住，(Intercept)如果我们想明确说明我们想要与 DC2$genotype 相关的对比度，则是第一个系数。 ，所以调用应该是:

toptable(fit, coef = 2)

自然地，如果设计包含更多对比，它们将被分配连续的自然数。

备注

如果我们想从设计中移除截距 design <- model.matrix(~ -1 + DC2$genotype) ;第一个系数现在是 DC2$genotype .